El incremento del personal de laboratorio, que debe trabajar desde casa en virtud del distanciamiento social, exige el uso de plataformas informáticas de trabajo remoto/a distancia para mantener la comunicación entre colegas y su productividad. Pero esta situación conlleva a un cambio en las formas de trabajar de los científicos y personal de laboratorio, por lo cual es necesario adaptarlas y aprovechar al máximo las plataformas remotas/a distancia. Si no se tiene una idea clara por dónde iniciar, este blog puede ayudarle.
A través de este blog, se proporcionan seis consejos que ayudarán a implementar una microscopía remota/a distancia:
1. Seleccionar las plataformas informáticas disponibles en su laboratorio
Las capacidades de una operación a distancia dependen en gran medida del tipo de infraestructura informática que posee su laboratorio.
El primer paso en el plan de una microscopía remota, es determinar las herramientas o software de reuniones web que pueden utilizarse, con el fin de evitar alguna restricción de red o cualquier otro aspecto de bloqueo en la infraestructura administrada por el servicio de tecnología informática (TI).
Asimismo, se tiene que probar si se presentan interrupciones inesperadas con el software. Por ejemplo, una actualización de Windows, que se ejecuta en el transcurso de la noche, podría requerir un reinicio de los dispositivos y, por consiguiente, incidir en la operación a distancia. Por lo que desactivar la actualización por un período determinado, bien que esta acción no siga necesariamente los protocolos TI de su organización, puede ayudar a prevenir este problema.
2. Configurar su observación microscópica en función de sus capacidades remotas actuales
El siguiente paso en el plan, es la configuración de su observación a distancia en función de lo que puede llevar a cabo de forma remota e in situ.
Gran parte de ello, puede depender de su microscopio y su experimento. En el caso de los microscopios totalmente motorizados, por lo general es posible configurar la observación y que siga su curso sin mayor intervención; sin embargo, las siguientes recomendaciones son proporcionadas como guía general:
- ¿Qué debe hacerse in situ? Configurar y enfocar la muestra, ajustar el collar de corrección, aplicar aceite de ser necesario e implantar el entorno informático remoto.
- ¿Qué debe hacerse a distancia? Ejecutar un procesamiento tras una configuración de enfoque aproximada, proseguir con los ajustes micrométricos para dicha observación, y analizar o compartir imágenes.
Si su sistema no ofrece una función de control u operación a distancia, vale la pena consultar las opciones que ofrecen los proveedores.
Por ejemplo, la mayor parte de los microscopios profesionales poseen una estructura modular que puede ser actualizada a un sistema motorizado. Además, hoy existen muchas herramientas dedicadas a la microscopía y las plataformas generales de reuniones web a fin de facilitar el control remoto, intercambio de imágenes u operación del microscopio.
De forma general, no se recomienda el uso de aceite para la observación remota debido a que su utilización es compleja bajo la modalidad de control remoto. En pocas palabras, no es posible aplicarlo a distancia y podría causar problemas en la calidad de la imagen, o hasta dañar sus dispositivos ópticos si su aplicación supera los límites recomendados o su limpieza no se hace de forma adecuada después de usarlo. Obviamente, esta recomendación no se aplica a un escáner de portaobjetos para la investigación que dispensa aceite automáticamente. Asimismo, en el caso de personas familiarizadas con la aplicación de aceite, es posible considerar la aplicación preliminar de aceite antes de comenzar el experimento.
Figura 1. Guía general sobre las tareas que deben hacerse in situ bajo una configuración de microscopía a distancia. Tenga en cuenta que la condición de la iluminación puede ser controlada a distancia en función de la configuración del microscopio.
3. Ajustar la parafocalización
La importancia del ajuste de la parafocalización (tb. parafocalidad) rara vez es tomada en cuenta, porque al observar físicamente a través de un ocular es muy fácil y rápido ajustar el enfoque fino después de girar los objetivos. Sin embargo en la microscopía remota/a distancia, la parafocalización bajo diferentes magnificaciones se vuelve un componente crítico para una observación sin problemas.
Al haber ajustado perfectamente la parfocalización, no se requerirá un ajuste del enfoque si la magnificación cambia. Consulte nuestra guía de procedimiento rápido para el ajuste de la parafocalización con una cámara. Tal como se establece en la guía, es importante ajustar la parafocalización a través de los oculares antes de ajustar la parafocalización de la cámara.
4. Comprobar la planitud de la platina
La planitud de la platina no puede ser ajustada a distancia, y puede causar que se pierda el enfoque en la muestra si se pasa por alto. La buena noticia es que comprobar la planitud de la platina es fácil. Simplemente desplace la platina en la dirección XY con una alta magnificación, la cual se dota de una profundidad focal poco profunda (explicada más adelante), cuando se encuentre en el laboratorio.
De no asegurar la planitud de la platina, el plano focal podría desplazarse hacia el plano Z de la muestra y eventualmente perder el enfoque de la muestra durante el recorrido XY. Ahora bien, algunas platinas de inserción de terceros poseen tornillos niveladores de ajuste, pero la platina de inserción Olympus está diseñada para proporcionar una platina plana sin ajustes.
5. Seguir las mejores prácticas para un enfoque a distancia en la microscopía
Mantener el enfoque es una de las operaciones a distancia más desafiantes; y, lo peor, es cuando un objetivo entra en contacto con la muestra; ya que tanto el daño que puede producirse en la muestra como en el dispositivo óptico es irreversible. Otro escenario aún peor, y que no puede ser arreglado a distancia, es cuando la muestra se cae del portamuestras de un microscopio invertido.
Entonces, ¿cómo pueden evitarse estas situaciones? Siga las siguientes cinco reglas generales para mantener un enfoque a distancia:
- Monitorear de forma minuciosa: Lo cierto es que es más fácil decirlo que hacerlo. Pero, lo crucial es la velocidad de refresco de los fotogramas en la imagen en vivo y el retardo en el movimiento real de Z. No obstante, existen ciertas maneras de mejorarlos. Primero, el agrupamiento o submuestreo en la configuración de adquisición de imagen es una forma general de mejorar la velocidad de refresco de los fotogramas. La frecuencia y el retardo de refresco también podrían verse afectados por la herramienta de reuniones web que utiliza. Algunas herramientas de conferencia/reuniones web se dotan de un menú de ajustes para determinar la calidad y la velocidad de refresco de la imagen. Se recomienda priorizar la velocidad, sobre todo cuando se busca el plano focal.
- Usar un enfoque paso a paso con una mayor profundidad de campo: Este enfoque puede evitar la situación en la que cada imagen se encuentra fuera de la profundidad de campo y no se muestra nítida. Si una imagen expone un desenfoque extremo, puede que sea imposible determinar si se debe aumentar o disminuir el enfoque. Por esta razón, evite que el enfoque en su objetivo se pierda fuera de la profundidad de campo. La profundidad de campo se determina con la
apertura numérica (A. N.). Un objetivo de alta apertura numérica tiene una profundidad de campo poco profunda. Por lo tanto, se recomienda ajustar el enfoque de una apertura numérica baja a alta, por lo general de baja magnificación a alta magnificación. Si se utiliza un microscopio confocal, la analogía sobre la «profundidad de campo más profunda» puede ser útil. Ya que una menor apertura confocal conduce a una menor profundidad de campo,
pruebe una apertura más amplia para poder identificar y enfocar la muestra cuando no es posible encontrarla o es demasiado tenue. Después de verificar la precisión del enfoque, determine la confocalidad y la potencia de láser apropiadas para la adquisición de la imagen.
Figura 2. (Izq.) Los objetivos de baja magnificación suelen tener una apertura numérica baja y una amplia profundidad de campo, lo que hace más visible el rango Z más amplio. (Der.) Los objetivos de magnificación alta con una apertura numérica alta tienen una profundidad de campo poco profunda. Si bien esto puede ayudar a ver sólo las muestras enfocadas, se corre el riesgo de perder el enfoque.
- Acercamiento remoto: Tal y como se ha mencionado anteriormente, un contacto con la muestra es el peor de los casos que debe evitarse en lo posible; por lo que, a distancia, es importante activar el acercamiento con cuidado. Si se usa un microscopio invertido, el acercamiento debe activarse desde la parte inferior. En el caso de los microscopios verticales, el acercamiento debe activarse desde la parte superior. Al desplazar fuertemente el eje XY, vale la pena mover el
objetivo antes de mover la platina.
Figura 3. (Izq.) Acercamiento a las muestras desde la parte inferior para los microscopios invertidos, y (der.) desde la parte superior para los microscopios verticales.
- Forma 3D de la muestra: Puede que una muestra no se presente en el mismo plano Z bajo diferentes posiciones del eje XY, lo que conllevaría a la pérdida de su enfoque cuando el desplazamiento se activa de forma muy rápida. La causa puede provenir de la propia muestra o de la planitud de la platina como se ha mencionado anteriormente. Al utilizar un objetivo de alta apertura numérica con una profundidad de campo poco profunda, es mejor desplazar el eje XY
ligeramente, ajustar el eje Z con cuidado y no activar un recorrido demasiado lejano sin un enfoque simultáneo. Al perder el enfoque, cambie en lo posible a un ajuste de profundidad de campo más amplio. Si está creando una imagen de aplicación mosaico, el mapa de enfoque permite determinar la información de altura del enfoque.
Figura 4. Si las muestras no se presentan en el mismo plano Z, se pierde el enfoque cuando el desplazamiento es demasiado lejano y rápido (a). En tal caso, se necesita ajustar nuevamente el enfoque (b) o tratar con otro objetivo.
- Atención al límite de enfoque: Para proteger su muestra y equipamiento, se puede aplicar un límite de enfoque. Para aquellas personas poco familiarizadas con esta función, la característica del límite de enfoque limita el rango de desplazamiento del eje Z. Por lo general, no es necesario cambiar el límite de enfoque. Pero si se cambia el ajuste o si se requiere observar una muestra inusualmente gruesa, como una placa con un fondo alto, la función del límite de enfoque podría impedir que el acercamiento sea suficiente para la muestra bajo observación. Tenga en cuenta que el ajuste del límite de enfoque puede hacerse sólo in situ porque se necesita verificar la distancia física entre un objetivo y una muestra.
Aunque, a través de esta publicación se proporcionan consejos para el enfoque a distancia, otra buena metodología es automatizar el enfoque. Puede aprender más sobre el enfoque automatizado en nuestro blog: «Cuatro consejos para lograr un sólido procesamiento de imágenes de células vivas estando menos tiempo en el laboratorio».
6. Usar un mapa para identificar la posición XY
Otro desafío de la observación remota/a distancia es que se puede perder la orientación de lo que se observa. Esto se debe a una serie de factores: velocidad de refresco de fotogramas limitada, retardo en la imagen en vivo, campo de visión (FOV) limitado y falta de visibilidad directa en el escenario del microscopio.
Usar un mapa es una solución útil. Mediante la configuración de la platina motorizada, es fácil crear un mapa de baja magnificación. Es primordial dedicar un poco más de tiempo a la creación de un mapa, ya que este permitirá identificar de forma inmediata y continua la orientación de su observación, y lo que es más importante, saltar a cualquier posición del mapa, según su interés, con un simple clic.
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